抽象
2017年，中國廣東省新生仔豬爆發嚴重腹瀉，導致分離並發現了一種新的豬腸道α- 冠狀病毒（SeACoV），其源自犀牛蝙蝠冠狀病毒HKU2（Y.Pan，X.Tian，P.Qin， B. Wang等人，《獸醫微生物學》 211：15-21，2017年）。SeACoV後來又被另一組稱爲豬急性腹瀉綜合徵CoV（SADS-CoV）（P。Zhou，H。Fan，T。Lan，X.-L。Yang等，Nature 556：255-258， 2018）。本研究成立調查的潛力品種SADS冠狀病毒的障礙在體外和體內。我們首先證明SADS-CoV具有廣泛的物種共性，並且能夠感染來自各種物種的細胞系，包括蝙蝠，小鼠，大鼠，沙鼠，倉鼠，豬，雞，非人類靈長類動物和人類。胰蛋白酶有助於SADS-CoV 體外繁殖，但並非必需。此外，通過口服或腹膜內途徑向C57BL / 6J小鼠接種病毒。儘管小鼠僅表現出亞臨牀感染，但它們支持病毒複製並延長了脾臟的感染時間。在淋巴濾泡邊緣的邊緣區域的脾細胞中檢測到SADS-CoV非結構蛋白和雙鏈RNA，表明SADS-CoV在小鼠模型中活躍複製。我們通過免疫熒光和流式細胞儀方法確定脾臟樹突狀細胞（DCs）是病毒感染的主要目標。最後，我們證明了SADS-CoV不會利用已知的CoV受體進入細胞。
重要信息蝙蝠起源的冠狀病毒（CoV）（嚴重急性呼吸道綜合症CoV [SARS-CoV]和中東呼吸綜合症CoV [MERS-CoV]）的感染已在“宿主跳躍”事件後在人類中引起嚴重疾病。最近，在中國南部出現了一種新型的蝙蝠HKU2型冠狀病毒，稱爲豬急性腹瀉綜合徵冠狀病毒（SADS-CoV），引起新生仔豬致命性腹瀉。評估SADS-CoV感染的物種障礙非常重要，因爲動物宿主（豬和蝙蝠除外）和人畜共患病潛力仍然未知。一種在體外藥敏研究表明，SADS-CoV具有廣泛的物種向性，包括各種齧齒動物和人類細胞系。我們建立了SADS-CoV感染的小鼠模型，確定了其在脾樹突狀細胞中的主動複製，這表明SADS-CoV具有感染齧齒類動物的潛力。這些發現凸顯了SADS-CoV的潛在跨物種傳播能力，儘管還需要在其他動物種羣中進行進一步監視以充分了解這種蝙蝠-HKU2起源CoV的生態。
介紹
人畜共患病原體的傳播仍然是全球公共衛生的主要威脅之一。冠狀病毒（COVS）可感染多種動物和人的，導致幾種疾病與各種嚴重程度（呼吸，腸，以及神經病理1 - 4）。由於各種感染途徑和組織中廣泛的吞噬作用，人與動物之間的緊密接觸爲適應性突變和種間傳播提供了潛在的可能性（5）。
嚴重急性呼吸綜合徵冠狀病毒（SARS-COV）的源被曝果子狸的動物市場，並最終以蝙蝠，導致超過8000所人感染，它的出現後，774人死亡，2002年（5 - 7）。中東呼吸綜合徵冠狀病毒（MERS冠狀病毒），2012年（出現2）導致1000多名臨牀病例，死亡率爲35％，使其成爲21世紀的第二個顯着威脅冠狀病毒（8，9）。儘管駱駝可以被MERS-CoV感染，但蝙蝠也被認爲是MERS-CoV的原始宿主（5）。既SARS冠狀病毒和MERS-CoV的起源於蝙蝠，示出在物種間傳輸事件引起COVS的破壞和高亮冠狀病毒相關疾病（的增加全球警惕需要1，5，10）。
2017年2月，中國廣東省的豬羣爆發了嚴重腹瀉的乳豬仔豬（11）。臨牀體徵包括急性嘔吐和水樣腹瀉，但在任何臨牀樣品中均未檢出通常與腹瀉有關的豬病毒，包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV），傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬三角冠狀病毒（PDCoV）。 （11）。這是孤立商品豬的新的腸道病原體，最終確定爲屬於種新的冠狀病毒豬菊頭蝠的蝙蝠冠狀病毒HKU2（11 - 13）。我們的研究小組暫時將該新出現的病毒命名爲豬腸道α冠狀病毒（SeACoV）（11），後來被Zhou等人命名爲豬急性腹瀉綜合徵CoV（SADS-CoV）。（14）。它也以其他名稱而聞名，例如豬腸道α冠狀病毒（PEAV）（13）。爲了統一起見，SADS-CoV是本研究中用來指代這種新病毒的名稱。蝙蝠起源的HKU2在豬中的寄主範圍擴大，表明蝙蝠在SADS-CoV的生態學和進化中起着重要作用，儘管蝙蝠到豬的傳播機制尚不清楚。鑑於SARS和MERS對動物和公共衛生造成的損害，必須特別注意人類和家畜中CoV相關疾病的流行（15）。
因此，迫切需要更多有關SADS-CoV感染細節的信息。評估SADS-CoV傳播的潛在物種障礙至關重要，因爲動物宿主（豬和蝙蝠除外）和人畜共患病潛力仍然未知。在本研究中，我們證明了SADS-CoV 在體外具有非常廣泛的物種嗜性，並且能夠感染來自各種物種（包括齧齒動物和人類）的細胞系。此外，體內SADS-CoV小鼠實驗感染的證據表明，脾臟樹突狀細胞（DCs）是SADS-CoV在小鼠中複製的主要部位。最後，我們證明了SADS-CoV不會利用已知的CoV蛋白受體進行細胞進入。這些結果表明，齧齒動物有可能成爲SADS-CoV的易感宿主，這突顯了SADS-CoV潛在的跨物種傳播性。
結果
SADS-CoV可以感染源自各種物種的細胞系。先前，我們報道了在補充胰蛋白酶的Vero細胞中分離出SADS-CoV（11）。由於外源胰蛋白酶對於PEDV分離株的體外繁殖至關重要（16），可能是通過S糖蛋白蛋白水解介導的膜融合激活（17），所以我們有興趣知道它是否也需要SADS-CoV在細胞培養中的生長。測試了總共24種源自人類和不同動物物種的組織的細胞系對用或不用胰蛋白酶處理的SADS-CoV的敏感性（表1）。作爲結果的簡要概述，在24種細胞系中，有21種表現出對SADS-CoV感染的顯着敏感性，這由有效的病毒複製，抗原表達和細胞病變效應（CPE）定義。沒有被SADS-CoV感染的三個細胞系是MDCK，BFK和RAW 264.7。
表格1
由CPE和IFA確定的人和動物細胞系及其對SADS-CoV感染的敏感性概述
首先，在感染後48小時（hpi）通過倒置光學顯微鏡檢查CPE，得分列於表1。由於293T，NIH / 3T3，CHO，BRL-3A和NRK-52E細胞系對胰蛋白酶敏感，因此無法對它們在MMT細胞中的SADS-CoV感染進行測試。除此之外，CPE在不含胰蛋白酶的Vero，ST和BRL-3A細胞系中可見，在Marc-145，Cos-7，BSC-40，Vero，ST，PK15， LLC-PK1和BHK-21細胞系（表1）。
由於SADS-CoV感染後某些細胞未顯示CPE，因此隨後通過免疫熒光測定（IFA）測試了所有細胞系的病毒M蛋白表達（圖1），揭示了在不同細胞系中CPE所見範圍相同（數據未顯示）。合胞體的形成在Huh-7，Vero和BHK-21細胞中很顯着，而在MDCK，BFK和RAW 264.7細胞中，抗原表達則不如其他細胞系顯着（圖1A，C和I）。 。正如M蛋白的表達所表明的那樣，測試的大多數細胞系均顯示出生產性感染的證據，而Marc-145，LLC-PK1和IPEC-J2細胞中抗原的低效表達僅表明感染有限。
圖。1
免疫熒光測定顯示不同細胞系對SADS-CoV感染的敏感性。使用兔抗SADS-CoV-M多克隆抗體（放大200倍）和Alexa Fluor 488偶聯抗兔IgG作爲二抗，對MODS爲0.01的SADS-CoV感染的細胞進行免疫熒光測定細胞核。用適當的相同程序處理模擬感染的細胞。測試了來自不同物種的細胞，包括蝙蝠（BFK和Tb-1）（A），倉鼠（CHO和BHK-21）（B），小鼠（NIH / 3T3和RAW264.7）（C），大鼠（ BRL-3A和NRK-52E）（D），人（Huh-7，HepG2、293T，A549和HeLa）（E），猴子（Marc-145，Cos-7，BSC-40和Vero）（F ），豬（ST，PK15，LLC-PK1和IPEC-J2）（G），雞（DF-1）（H），狗（MDCK）（I）和沙鼠原發性腎細胞（J）。
接下來，通過逆轉錄酶定量PCR（qRT-PCR）在感染後（dpi）的5天內檢測培養物上清液中的病毒載量（圖2A至C）。在HepG2，HeLa，Marc-145，Cos-7，BSC-40，Vero，LLC-PK1，IPEC-J2，BHK-21和DF-1細胞中用胰蛋白酶處理後，通過qRT-PCR檢測到較高的平均病毒載量。因此，胰蛋白酶有助於SADS-CoV在這些細胞系中繁殖，但並非必需。胰蛋白酶處理後，其他細胞系中沒有差異，儘管不論胰蛋白酶處理如何，Huh-7和Tb-1細胞均具有高水平的SADS-CoV RNA。
圖2
感染後5天，SADS-CoV在不同細胞系中的生長。爲了確定胰蛋白酶對SADS-CoV感染的作用，在以下三種條件下感染每種細胞系：“無胰蛋白酶”處理，接種在維持培養基（MM）中稀釋的SADS-CoV 2 h，然後用MM（一種）; “預胰蛋白酶”處理，接種在含有5μg/ ml胰蛋白酶（MMT）的MM中稀釋的SADS-CoV接種2 h，然後用MM（B）代替；和“雙重胰蛋白酶”治療，在MMT中接種SADS-CoV，然後替換爲MMT（C）。在12、24、36、48、72和120 hpi收集感染上清液，通過靶向病毒N基因的qRT-PCR分析檢測病毒載量。數據表示爲平均病毒載量（log 10拷貝數/微升）±標準差（SD），所有實驗均一式三份進行。293T，CHO，BRL-3A和NRK-52E細胞系在胰蛋白酶存在下無法存活。（D）在Vero細胞上測定從HeLa，Vero，Tb-1，BHK-21 PK-15和MDCK細胞分泌的SADS-CoV的感染滴度（TCID 50 / ml）。
通過滴定Vero細胞中的上清液，確定感染性SADS-CoV向六個感染SADS-CoV的代表性細胞系的培養基中的逐步釋放（圖2D）。與在MDCK細胞中不同，HeLa，Vero，Tb-1，BHK-21和PK-15細胞的SADS-CoV感染具有生產力，而HeLa細胞顯示出最大的敏感性（圖2D）。
SADS-CoV可以通過口服和腹膜內途徑感染野生型C57BL / 6J小鼠。通過觀察到SADS-CoV可以感染各種齧齒動物細胞系（來自小鼠，大鼠和倉鼠以及沙土原代腎細胞），我們假設小鼠可能對SADS-CoV敏感。爲了對此進行測試，我們通過口服（po）或腹膜內（ip）給SADS-CoV 接種5至10 5 50％組織培養感染劑量（TCID 50）的6至8周齡野生型B6小鼠並對其進行28天的臨牀症狀監測。小鼠在感染期間沒有屈服，也沒有腹瀉或體重減輕的現象（數據未顯示）。
爲了確定SADS-CoV是否無症狀感染動物，分別以1、3、5、7、14、21和28 dpi收集了接種小鼠的組織和糞便樣品，以確定病毒的生長動力學和脫落。通過qRT-PCR分析組織樣本表明，在腹腔或口服感染後早期SADS-CoV在胃中適度複製，在7或14 dpi以後下降並達到不可檢測的水平（圖3A）。在小腸的每個區域都觀察到非常有限的病毒複製，通過ip感染的迴腸顯示出連續且可檢測的病毒RNA（圖3B））。在大腸中，ip感染還會導致盲腸中每個時間點的病毒RNA載量略高於檢測極限，而導致1-3 dpi時更高的病毒RNA水平，而在21到28 dpi時導致更低的病毒RNA水平結腸中的dpi高於po途徑的dpi（圖3C）。然而，在大腸中的這種複製並沒有轉化爲更高的脫落，因爲幾乎沒有檢測到任何病毒基因組，即使在從ip感染的小鼠收集的糞便樣品中甚至在1 dpi時也是如此（圖3F）。相反，在1和3 dpi的po感染小鼠的糞便中檢測到明顯更多的病毒，這表明ip接種不會導致更高的病毒脫落。
圖3
小鼠的SADS-CoV感染。C57BL / 6J WT小鼠經口服（po;黑色）或腹膜內（ip;紅色）用5×10 5 TCID 50的純化SADS-CoV感染。不同組織樣本中的病毒載量，包括胃（A），小腸段（B），大腸段（C），淋巴組織（D），其他器官（肝，腎，心臟和肺）（E），通過qRT-PCR確定在感染後1、3、5、7、14、21和28天收集的糞便（F）。MLN，腸繫膜淋巴結。數據來自三個獨立的實驗，每個符號代表單個樣品的滴度（*，P <0.05）。檢出限爲1×10 2基因組拷貝/ mg。（G）使用基於純化的SADS-CoV病毒顆粒的ELISA，在安樂死收集的血清樣品中檢測到SADS-CoV IgG抗體。
最後，SADS-CoV在腹膜內途徑後在脾臟中複製效率更高，在21 dpi時病毒RNA載量明顯更高（圖3D）。更重要的是，ip感染組的28 dpi和po感染組的14 dpi沒有從組織清除病毒，這表明SADS-CoV延長了脾臟感染的速度，與接種途徑無關。與脾臟相反，在腸繫膜淋巴結（MLNs）的局部淋巴組織中，在1-3 dpi時僅檢測到極低水平的病毒RNA，在以後的時間點未檢測到病毒（圖3D）。我們還在其他腸外部位（包括心臟，肺，肝，腎和血液）中尋找病毒，但它們均爲陰性或水平極低（圖3E）。）。基於SADS-CoV病毒體的酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測到7天后，IgG抗體水平表明ip途徑可有效引發宿主免疫應答（圖3G）。
脾細胞支持SADS-CoV複製。使用上述小鼠感染模型，我們的下一步是確定SADS-CoV 在體內的細胞嗜性。因此，我們在3 dpi的腹腔內感染SADS-CoV的5×10 5 TCID 50的小鼠的小腸和大腸和脾臟切片上進行了免疫組織化學（IHC）。針對雙鏈RNA（dsRNA）的單克隆抗體用於鑑定支持活性病毒複製的細胞，因爲dsRNA是僅在細胞內病毒複製期間存在的中間體。SADS-CoV dsRNA信號在淋巴濾泡邊緣的邊緣區和小動脈周圍淋巴細胞鞘的邊緣的脾臟白髓中觀察到（圖4A））。來自模擬感染的小鼠的組織切片的染色用作對照（圖4B）。除了dsRNA，我們還使用了兔多克隆抗體（pAbs）來檢測病毒結構蛋白（M）或非結構蛋白（Nsp3-AC）的表達。在3 dpi時，在淋巴結節周圍的白色牙髓中觀察到抗M或抗AC染色（圖4C），類似於dsRNA染色的定位（圖4A））。來自SADS-CoV或用免疫前血清探測的模擬感染小鼠的組織切片呈陰性，表明SADS-CoV抗體的特異性。不幸的是，在感染小鼠的腸道中均未檢測到病毒蛋白（結構性或非結構性）或dsRNA，這與通過qRT-PCR在這些組織中僅檢測到非常低水平的病毒RNA一致（圖3）。
圖4
SADS-CoV在小鼠脾細胞中複製。使用抗dsRNA抗體對腹膜內感染的小鼠（A）和模擬感染的小鼠的脾臟切片進行蘇木和曙紅染色（HE）並以3 dpi（B）對脾臟切片進行免疫組織化學（IHC）鑑定以支持支持活性病毒複製的脾細胞。（C）使用SADS-CoV非結構蛋白抗體（anti-AC）和結構蛋白抗體（anti-M）的IHC也可以檢測SADS-CoV感染。比例尺= 50μm，除了右側顯示的放大場外，比例尺= 10μm。（D）在Vero細胞中驗證SADS-CoV抗體以開發流式細胞儀檢測。在24 hpi感染SADS-CoV（MOI，0.1）的Vero細胞的流式細胞儀圖; 用抗N或抗AC染色。（E）使用抗AC抗體以3 dpi的流式細胞儀檢測感染小鼠脾細胞中SADS-CoV的Nsp3-AC抗原。數據表示爲出於統計目的，相對於模擬感染組，感染小鼠的脾細胞染色脾細胞的增加倍數（左）；*，P ＜0.05。（F）（E）的代表性FACS圖。來自po或ip接種小鼠的實線框門控抗AC陽性脾細胞。還顯示了僅用二抗染色的模擬感染細胞的圖。（G）用MODS爲1的SADS-CoV感染分離的小鼠脾細胞，用抗N抗體的IFA檢測SADS-CoV N蛋白表達。（H）使用抗AC抗體在感染後的脾細胞中在48hpi的流式細胞術檢測SADS-CoV的非結構蛋白抗原。出於統計目的，數據表示爲染色細胞相對於模擬感染細胞的增加倍數（左）；*，P ＜0.05。（I）通過靶向SADS-CoV N基因的qRT-PCR在72 hpi內監測SADS-CoV在離體脾細胞中的生長。
接下來，使用流式細胞儀對脾臟中的SADS-CoV感染進行定量。我們用5×10 5 TCID 50 ip或po病毒接種B6野生型小鼠，並以3 dpi從受感染動物的脾臟中提取大量免疫細胞。流式細胞儀方法首先在以0.01的感染複數（MOI）感染SADS-CoV的Vero細胞中得到驗證，然後在24 hpi時針對N或AC蛋白用pAb染色（圖4D）。由於抗AC pAb對病毒信號表現出最佳的細胞內染色（圖4D），用於確定感染的脾細胞的百分比。經po和ip接種後，病毒複製陽性的總脾細胞分別增加了約1.5倍和2.5倍（圖4E，左；圖4F），其中AC陽性脾細胞的總數顯着增加。 ip感染的小鼠與po感染的小鼠相比（圖4E，右）。這些數據與po接種小鼠中1和3 dpi時脾臟中病毒載量顯着降低一致（圖3D），表明病毒的傳播和複製能力更好，並能逃脫粘膜免疫清除。
然後我們通過評估抗原的產生和體外複製動力學來評估SADS-CoV在脾細胞中的生長特徵。首先從幼稚的小鼠中提取脾細胞，接種在100 mm的培養皿中，並用1×10 5 TCID 50的SADS-CoV感染。我們觀察到被吞噬細胞吞噬的感染細胞簇（圖4G，中間），通過共聚焦顯微鏡觀察，感染細胞的細胞質中顯示出結構N蛋白（圖4G，中間和右側）。通過使用抗AC pAb的流式細胞術對感染細胞的百分比進行定量，發現對病毒信號呈陽性的脾細胞幾乎增加了2倍（圖4H）），與體內觀察到的感染百分比非常相似。爲了進一步表徵SADS-CoV在原代脾細胞中的生長動力學，用1×10 5 TCID 50的SADS-CoV 感染細胞，並在0、12、24、48和72 hpi收穫培養上清液。確認了活躍的病毒複製，基因組RNA等效物以1.5個對數的時間依賴性增加，從24 hpi穩定到72 hpi（圖4I）。這些數據表明，儘管僅約2％的脾細胞被感染，並且這些細胞支持了相當水平的病毒複製。總之，這些結果表明SADS-CoV可有效感染小鼠脾細胞。
脾臟DC支持SADS-CoV複製。以3 dpi的劑量從經ip感染的小鼠中收穫脾細胞，並將提取的細胞與針對SADS-CoV-AC的抗體和四種細胞表面標誌物（針對B細胞的抗CD19，針對T細胞的抗CD4，使用流式細胞儀檢測DC的CD11 / c +和對巨噬細胞的抗F4 / 80 +（圖5A）。被感染的CD11 / c +細胞的百分比顯着高於其他細胞亞組，表明DC是脾臟SADS-CoV感染的主要靶標。
圖5
通過ip途徑接種的小鼠脾臟中樹突狀細胞的SADS-CoV感染。（A）以3 dpi的速度從感染的小鼠中提取脾細胞，並使用流式細胞儀檢測SADS-CoV的非結構抗原AC和脾細胞上的免疫細胞標記物，包括B細胞（CD19 +），T細胞（CD4 +），巨噬細胞（F4 / 80 +）和樹突狀細胞（DC； CD11c +）。數據表示爲出於統計目的，來自感染小鼠的陽性染色細胞相對於模擬感染細胞的增加倍數；***，P <0.001。（B）以3 dpi的腹膜內（ip）感染小鼠（B）和模擬感染小鼠（C）脾臟切片中SADS-CoV dsRNA和DC標記CD11c的免疫熒光測定。（D）也可以使用抗AC和抗M抗體通過IFA檢測SADS-CoV感染。計算ip感染小鼠中SADS-CoV陽性DC的數目，並從10至15個不同視野（E）取平均值，並用維恩圖（F）表示感染細胞中DC的比例。比例尺= 50μm，除了右側顯示的放大場外，比例尺= 10μm。
通過在脾臟切片中用抗dsRNA，抗M或抗AC抗體加抗CD11 / c +對IFA進行雙染色進一步證實了該表型。如預期的那樣，dsRNA染色與淋巴濾泡邊緣的CD11 / c表面標記重疊（圖5B），而在模擬感染的對照中未見病毒信號（圖5C）。M和AC抗體檢測到相似的共濟模式（圖5D）。爲了瞭解與其他未定義靶細胞相比DC的相對數量，在10到15個不同顯微鏡視野的3只受感染小鼠的脾臟中對dsRNA和CD11 / c陽性的細胞進行了計數（圖5E）， SADS-CoV感染的細胞是DC（圖5F）。
SADS-CoV沒有利用已知的CoV蛋白受體進行細胞進入。據我們所知，這些結果揭示了已知CoV中最廣泛的細胞嗜性，表明SADS-CoV的功能性受體很可能是非常常見的分子。爲了檢驗該假設，首先必須找到僅在內化步驟中難於感染的細胞系。在早期感染測試中顯示出無法檢測到病毒產生的MDCK細胞（圖1和2）被選爲潛在候選者。有四種已知類型的功能CoV蛋白受體，包括SARS-CoV的血管緊張素轉化酶2（ACE2）（18），MERS-CoV的二肽基肽酶4（DPP4）（19），氨基肽酶N（APN）用於TGEV（20）和PDCoV（21，22），以及用於小鼠肝炎病毒的小鼠癌胚抗原相關細胞粘附分子1A（mCEACAM1a）（MHV）（23）。爲了測試這些分子之一是否充當SADS-CoV受體，我們嘗試用SADS-CoV接種過表達豬APN，人DPP4，小鼠CEACAM1a或人ACE2的不易感染的MDCK細胞，但都不允許感染，因爲抗SADS-CoV-N pAb陰性（圖6A）。同時，通過IFA（圖6A）和蛋白質印跡分析（圖6B）證實了MDCK細胞中每種受體的表達。）使用針對與受體融合的標籤的抗體。我們確認，作爲陽性對照，用TGEV，SARS-CoV，MERS-CoV或MHV穗型假型化的慢病毒（即假病毒）有效進入外源表達各自受體的MDCK細胞（圖6C）。
圖6
SADS-CoV利用未知的受體進入細胞。（A）在表達質粒轉染後24小時內，過表達與檢測標籤（pAPN-Flag，hDPP4-Flag，mCEACAM1a-Flag或hACE2-GFP）融合的四個已知CoV受體中的每一個的MDCK細胞均未表達SADS-CoV感染。 。在48小時時，將轉染了pAPN-Flag，hDPP4-Flag或mCEACAM1a-Flag的SADS-CoV接種細胞與小鼠抗FLAG MAb和兔抗SADS-CoV-N pAb共染色。將Alexa Fluor 488偶聯的抗小鼠IgG和Alexa Fluor 594偶聯的抗兔IgG染色，用於二抗檢測，然後進行DAPI孵育。對於用hACE2-GFP轉染的***細胞，使用抗SADS-CoV-N pAb和Alexa Fluor 594偶聯的抗兔IgG。放大倍數= 200×。（B）蛋白質印跡分析還證實了轉染的MDCK細胞中CoV受體的表達。（C）TGEV-，SARS-CoV-，MERS-CoV-或MHV-spike介導的假病毒進入過表達相應受體的MDCK細胞。僞病毒進入效率的特徵是伴隨進入的熒光素酶活性。用空骨架載體轉染的細胞用作對照。（D）在用SeACoV感染性cDNA克隆轉染的MDCK細胞中拯救SADS-CoV。轉染後72 h，通過與兔抗AC pAb和小鼠抗N pAb共同鑑定（放大倍數= 200倍），檢測SADS-CoV中Nsp3-AC和N蛋白的表達。（E）用在MDCK細胞中拯救的後代SADS-CoV感染新鮮的Vero細胞。通過在36hpi用抗N pAb染色來檢測SADS-CoV N蛋白的表達。
接下來，我們證明了MDCK細胞可以通過轉染最近建立的SADS-CoV / SeACoV傳染性cDNA克隆來賦予SADS-CoV複製能力（24），因爲NFA3-AC和N蛋白的同時表達可以被IFA清楚地檢測到（圖。 6D）。此外，pSEA轉染的MDCK細胞上清液傳代到新鮮的Vero細胞上會導致子代SADS-CoV感染，這由N蛋白的表達證明（圖6E）），表明MDCK細胞也可以支持傳染性SADS-CoV的產生，而不會在細胞間擴散。因此，SADS-CoV顯然不利用任何已知的CoV受體進行細胞進入。使用HeLa細胞過量表達四種經典CoV受體中的每一種，然後用Zhou等人的SADS-CoV接種，得出了相同的結論。（14）; 然而，在本研究中，HeLa細胞系本身最容易受到SADS-CoV感染（圖2D）。
討論
爲了評估SADS-CoV感染的潛在物種障礙，首先使用24種不同細胞系進行了細胞系敏感性研究。由於SADS-CoV可能起源於蝙蝠SADSr-CoV（14），來源於中國犀牛（12）中鑑定出的HKU2-CoV （12），因此我們開始在兩種可用的蝙蝠細胞系中檢測病毒敏感性，即Myotis的 BFK 巴西Tadarida的daubentonii（25）和Tb-1 。儘管BFK細胞不支持SADS-CoV複製，但它可以在Tb-1細胞中有效複製（圖1A和圖2）。），這表明除馬蹄蝠以外，其他蝙蝠物種也可能易受SADS-CoV感染。
有趣的是，幾乎所有齧齒動物細胞（倉鼠，沙鼠，小鼠和大鼠）（包括BHK-21）都檢測到SADS-CoV蛋白表達，而BHK-21對其他已知的人類CoV（例如SARS-CoV和MERS-CoV）不敏感（26，27），以及三個豬腸溶COVS，即PEDV，PDCoV，和TGEV（21）。鑑於SADS-CoV既感染齧齒動物又感染原代和傳代或原代細胞系的事實，我們假設齧齒動物可能易受SADS-CoV感染。爲了探索這種可能性，我們通過兩種不同的接種途徑用SADS-CoV***了野生型B6小鼠。
受***的動物既不屈服於感染也不表現出任何腸胃炎的跡象。實際上，在我們的實驗室中，實驗性感染高純度SADS-CoV的新生仔豬隻會導致輕度的腹瀉症狀或亞臨牀感染（11）。同樣，在感染過程中，腸道中缺乏強健的病毒複製，並且在整個腸道中均未檢測到組織損傷（圖3B和C），這反映了SADS-CoV在具有免疫能力的野生型小鼠中的感染效果欠佳。相反，病毒在脾臟中具有更有效的複製，這可以通過在28天的所有時間點在免疫細胞中連續檢測到病毒基因組RNA來反映（圖3D））。該表型也與體外提取的脾細胞的複製動力學一致，其中病毒基因組RNA在72hpi達到高峯和穩定（圖4G和I。）。這些數據共同導致人們推測SADS-CoV比其他組織更傾向於脾臟細胞。對於病毒複製中這些組織特異性差異的最合乎邏輯的解釋是（i）靶細胞在脾臟中更集中，在腸道中更零星分佈；或（ii）脾臟免疫細胞在腸中的未知受體表達增強。細胞。這些動物更容易受到腹膜內感染，導致小腸，大腸和脾臟的遠端部分病毒複製增多，盲腸中的病毒感染清除延遲（圖3B至E）。），表明粘膜免疫在控制SADS-CoV小鼠早期感染中具有重要作用。應當指出，小鼠（本研究中的C57BL / 6J小鼠）可能不是SADS-CoV感染的最佳齧齒動物物種，因爲野豬在中國養豬場中更爲常見。另外，可以考慮其他傳輸路徑。近來，PDCoV已經顯示出除了糞-口傳播之外還可能通過呼吸途徑傳播（28）。因此，在未來的研究中嘗試鼻內途徑在大鼠或其他齧齒類動物中進行接種以模仿SADS-CoV自然傳播是很有趣的。
更有趣的是，我們確定DC是支持SADS-CoV複製的精確細胞羣（圖5）。有幾篇關於CoV的免疫細胞嗜性的報道。巨噬細胞易受MHV感染，代表了最大的先天免疫細胞羣，它們在被嗜神經性MHV菌株感染後滲入中樞神經系統（29）。此外，基於SARS-CoV穗型假型HIV載體可以有效地轉導人DC的事實，Kobinger等人。假設未成熟DC中的SARS-CoV感染會導致病毒發病（30）。楊等。證明SARS-CoV可以通過S糖蛋白相關的細胞進入和DC感染介導的病毒向其他細胞的傳播來感染髓樣DC體內（31）。這些先前的證據支持我們目前的結果，表明SADS-CoV可以在DC中有效複製。
此外，這項研究爲我們提供了一種新穎的啓示，即齧齒類動物除蝙蝠和豬外還可能成爲SADS-CoV的易感宿主。值得注意的是，物種菊頭蝙蝠α-CoV的HKU2，包括SADS-CoV的，具有類似於一些全球分佈的齧齒類α-COVS（密切相關的乙型（β-COV）獨特的S基因，以這樣的方式11，32，33），表明蝙蝠α-CoVHKU2與齧齒動物α-CoV之間存在未知的進化聯繫。在中國的田間條件下，豬與蝙蝠之間直接接觸的可能性很小。但是，在養豬業中經常見到齧齒動物（尤其是老鼠），由於飼料損失而造成很大的麻煩。當蝙蝠在豬場附近捕食昆蟲時，它們可能會留下含有HKU2樣冠狀病毒的糞便，這些糞便會污染豬的飼料，然後被豬和齧齒動物食用，隨後成爲SADS-CoV的攜帶者。越來越多地將大鼠和小鼠作爲外部載體用於多種不同的豬病原體，例如胞內勞森菌（34）。齧齒動物不僅傳播病原體，而且危害養豬業的從業人員，因爲它們被認爲是豬和養豬工人鉤端螺旋體病的主要來源（35）。今後有必要在養豬場附近的齧齒動物中鑑定SADS-CoV陽性樣品，以驗證這一假設。
除齧齒動物外，我們還測量了人，猴，雞和狗的細胞系對SADS-CoV的敏感性，揭示了非常廣泛的向性性（表1和圖1）。至於SADS-CoV在人細胞系中有效生長的能力，我們不應低估這種蝙蝠起源的CoV可能從豬“跳”到人的風險。值得注意的是，駱駝工人的駱駝鼻腔和口腔分泌物暴露率很高，有MERS-CoV感染的證據（36）。考慮到SARS-CoV和MERS-CoV起源於蝙蝠，並通過中間宿主（分別爲麝香和駱駝）從一種物種傳播到另一種物種，因此SADS-CoV可能通過從豬或其他易感宿主傳播而對人類健康構成類似的風險。
細胞敏感性研究和非敏感性MDCK細胞中四種已知CoV受體過表達的測試（圖6）表明SADS-CoV可能使用了蝙蝠，豬，齧齒動物，雞，猴和人類中保守的新受體分子，表明跨物種傳播的障礙很小。這與SADS-CoV的廣泛物種向性性不同尋常。
總之，這些結果爲這種蝙蝠起源的CoV的生態學提供了重要的見解，突出了其跨越種間障礙的能力的可能性以及齧齒動物作爲該領域易感宿主的潛在作用。爲了充分了解SADS-CoV的生物學特性，需要鑑定未知的SADS-CoV細胞受體並進一步監視其他動物種羣。
材料和方法
病毒庫和病毒抗體。所有實驗均使用第10代的SADS-CoV分離株CH / GD-01 / 2017，並在Vero細胞中培養（24）。使用培養上清液對病毒進行連續傳代，以0.1的感染複數（MOI）感染新鮮的Vero細胞，並通過終點稀釋以50％組織培養感染劑量（TCID 50）確定Vero細胞中的病毒滴度。針對SADS-CoV的膜（M），核衣殼（N）和非結構蛋白3（Nsp3）酸性域（AC）的兔多克隆抗體（pAb）是在內部產生的，並已在SADS-CoV感染的Vero細胞中進行了驗證（24）。還產生了小鼠抗SADS-CoV-N pAb，與兔pAb混合後可進行兩次染色。針對dsRNA的單克隆抗體（MAb）（抗dsRNA MAb J2；目錄號J2-1702，Scicons，匈牙利）用於特異性檢測SADS-CoV的病毒複製。
細胞系和細胞培養。使用了來自不同物種組織的二十四個細胞系（表1），包括人（Huh-7，HepG2 / C3A，293T，A549和HeLa），猴（Marc-145，Cos-7，BSC-40）和Vero），豬（ST，PK15，LLC-PK1和IPEC-J2 [ 37 ]），蝙蝠（BFK [ 25]和Tb-1），犬科動物（MDCK），小鼠（NIH / 3T3和RAW 264.7），倉鼠（BHK-21和CHO），大鼠（BRL-3A和NRK-52E）和雞（DF-1）細胞品系和蒙古沙鼠的原代腎細胞系（內部製備）。BFK細胞系是中國長春軍事獸醫研究所塗長春的慷慨禮物。將每種細胞系在37°C下於補充有10％（vol / vol）胎牛血清（FBS; Biological Industries），100 U / ml青黴素和100 U / ml鏈黴素的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM; HyClone）中培養，5％的CO 2和水飽和的溼度條件。
爲了確定病毒敏感性，將每種細胞系在含有固定培養基（MM）的12孔板中以70％融合度培養，該培養基包含DMEM，0.3％磷酸胰蛋白try肉湯（TPB）和1％青黴素-鏈黴素或MM，加入5μg / ml胰蛋白酶（MMT）（目錄號T7186-50TAB； Sigma，美國密蘇里州聖路易斯）。用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）洗滌細胞後，將它們用稀釋在MM或MMT中的SADS-CoV以0.01的MOI接種2小時。通過用DMEM洗滌細胞3次來去除未附着的病毒，然後將細胞單層細胞在MM或MMT中於37°C孵育5天。爲了確定胰蛋白酶對病毒進入的作用，在以下三個條件下用SADS-CoV感染細胞單層：（i）不進行胰蛋白酶處理，用在MM中稀釋的SADS-CoV感染，隨後在MM中孵育；（ii）胰蛋白酶前處理，接種用MMT稀釋的SADS-CoV，然後在MM中孵育；（iii）雙胰蛋白酶處理，在MMT中接種SADS-CoV，隨後在MMT中孵育。在感染後（hpi）12、24、36、48、72和120小時收集來自細胞的上清液，用於一步定量RT-PCR分析。在48至72 hpi時檢查細胞培養物的細胞病變效應（CPE）和免疫熒光測定。
IFA對細胞系的敏感性。將在12孔板中感染SADS-CoV的不同細胞用PBS洗滌兩次，並固定在PBS中的4％多聚甲醛中，然後用0.1％的PBS中的Triton X-100***。然後將細胞與兔抗SADS-CoV-M pAb以1：5,000的稀釋度在37°C下孵育1小時，在PBS中洗滌，並用Alexa Fluor 488偶聯的山羊抗兔二抗（Thermo Fisher科學，美國）以1：1,000稀釋。在37℃下溫育1小時後，將細胞用PBS洗滌，用1∶1,000稀釋的4′，6-二mid基-2-苯基吲哚（DAPI）染色並在熒光顯微鏡上觀察。
靶向N基因的一步定量RT-PCR分析。使用兩個獨特的限制性酶切位點，即NdeI和XhoI，將全長SADS-CoV N基因插入經過適當消化的pET-28a載體中，然後用XhoI線性化。使用T7高效轉錄試劑盒（北京TransGen Biotech Co.，Ltd.）在體外轉錄N基因。使用已知量的N基因RNA的稀釋液生成標準曲線，以實現樣品中SADS-CoV RNA拷貝數的絕對定量。
按照製造商的說明，使用Trizol（ThermoFisher Scientific，USA）從培養上清液或組織勻漿中提取總RNA。SADS-CoV RNA效價是通過用引物5′-CTAAAACTAGCCCCACACGGTC-3′和5′-TGATTGCGAGAACGAGACTG-3′和探針6-羧基熒光素（FAM）靶向N基因的一步法qRT-PCR（Toyobo Co.，Ltd.）確定的）-GAAACCCAAACTGAGGTGTAGCAGG-6-羧基四甲基羅丹明（TAMRA）。基於使用RNA標準品的驗證數據，循環閾值<35的樣品被認爲是陽性的。
小鼠感染，組織收穫和病毒載量測定。野生型C57BL / 6J小鼠（目錄號000664；傑克遜實驗室）購自南京大學模型動物研究中心，並在無特定病原體的條件下飼養在浙江大學的動物設施中。對於SADS-CoV感染，在6至8周大的雌性和雄性小鼠中，每次口服（po）感染5×10 5 TCID 50（等於6×10 8基因組拷貝）SADS-CoV。 25μl接種物（2×10 7 TCID 50 / ml）或腹膜內（ip）感染200μl接種物（2.5×10 6 TCID 50/ ml）。爲了確定特定組織中的病毒載量，在感染後（dpi）第1、3、5、7、14、21和28天對小鼠實施安樂死，並收集組織，包括胃，十二指腸，空腸，迴腸，盲腸，結腸，腸繫膜淋巴結，脾臟，腎臟，肝臟，心臟，肺，血液和糞便。稱重組織，並使用無菌氧化鋯珠（產品目錄號ZrOB20； MidSci）通過珠打將其在培養基（DMEM含2％FBS）中勻漿。如上所述，從組織勻漿中提取總RNA，並通過針對SADS-CoV N基因的定量RT-PCR分析進行測試。從心臟收集血液樣本，並分離血清以檢測病毒特異性抗體。
酶聯免疫吸附測定。通過蔗糖密度梯度離心法從感染的細胞培養上清液中純化SADS-CoV病毒顆粒，並通過二辛可寧酸（BCA）蛋白測定試劑盒（Beyotime Biotechnology，上海，中國）測定蛋白濃度。抗原的最佳稀釋度通過方滴定法確定。在以純化的SADS-CoV病毒顆粒（6.25 ng /孔）作爲抗原包被的孔中檢測到以1：100稀釋度包含在血清中的IgG抗體。
小鼠脾臟的組織病理學，免疫組化和免疫熒光測定。小鼠經SADS-CoV腹膜內感染，並在3 dpi時收穫脾臟，並在4％多聚甲醛中固定24小時，然後包埋在石蠟中。然後將組織切片脫蠟並在三份二甲苯中重新水化，每次15分鐘，在二份純乙醇中脫水5分鐘，然後在85％和75％乙醇梯度中再水化。用蒸餾水洗滌組織後，將它們進行蘇木精和曙紅染色以進行組織病理學檢查。
對於抗原回收，將去石蠟和覆水的切片浸入檸檬酸鈉抗原回收溶液（pH 6.0）中，並在低於沸點的溫度下保持8分鐘，在98°C下放置8分鐘，然後在低於沸點的溫度下再次孵育7分鐘。 。將切片冷卻至室溫（RT），並用PBS（pH 7.4）洗滌3次後，將內源過氧化物酶通過在RT中浸入3％過氧化氫中封閉30分鐘，然後再次用PBS洗滌。在室溫下，將組織切片在3％牛血清白蛋白（BSA）中封閉30分鐘，然後與每種一抗（抗dsRNA MAb，抗SADS-CoV-M pAb或抗SADS的1：500稀釋液一起孵育） -CoV-AC pAb）在4°C下過夜。用PBS（pH 7.4）將玻片洗滌3次後，在室溫下，將它們用標記有辣根過氧化物酶的適當二抗染色50分鐘。加入新鮮製備的二氨基聯苯胺顯色試劑，用蘇木精復染，然後脫水並在光學顯微鏡上觀察。
將自發熒光猝滅劑（武漢服務生物技術有限公司，武漢，中國）添加到組織切片中，並在抗原回收後孵育5分鐘。然後將切片在流水中洗滌，然後如上所述進行封閉和抗體染色。另外，第一抗體補充有1：200稀釋度的CD11c抗體（武漢服務生物技術有限公司），然後用適當的第二抗體染色。最後，加入DAPI，並在熒光顯微鏡下觀察切片。用DAPI標記的細胞核呈藍色，通過CD11 / c標記的陽性細胞爲綠色，而通過病毒特異性抗體的標記則爲紅色。
鼠脾細胞的製備和流式細胞儀。以3 dpi對被SADS-CoV感染的小鼠實施安樂死，並取出脾臟並將其置於5 ml完整DMEM中。使用5 ml注射器的柱塞端將切除的脾臟通過100μm細胞過濾器研磨後，用過量的DMEM洗滌細胞，並以200× g離心 5分鐘。將細胞重懸於3 ml紅細胞裂解緩衝液（Solarbio Life Sciences，北京，中國）中，並在室溫下孵育10分鐘後，添加5 ml DMEM，並將細胞通過另一個濾網除去團塊。以200× g離心 5分鐘後，棄去上清液，將細胞重懸於10 ml新鮮DMEM中，用臺盼藍和血細胞計數器進行細胞計數和活力檢查。
對於流式細胞術，將培養的細胞重懸於Fc Block緩衝液（含有1：500稀釋度的抗小鼠CD16 Fc Block抗體），並在冰上孵育。將Fc Block緩衝液中的細胞以1×10 6個細胞/孔添加到96孔板中。孵育30分鐘後，將細胞以200× g離心 10分鐘，棄去上清液，將沉澱重懸於100μlCytofix / Cytoperm溶液（Cytofix / Cytoperm溶液試劑盒； BD Biosciences，加利福尼亞州聖何塞） （美國）修復細胞。在避光的冰上孵育20分鐘後，將細胞以800× g離心 在4°C下放置5分鐘，在不干擾細胞沉澱的情況下除去上清液，並將細胞在150μl的1x Perm / Wash緩衝液中洗滌兩次。加入50μl病毒特異性一抗（抗dsRNA MAb，抗SADS-CoV-N pAb或抗SADS-CoV-AC pAb）後，用含3％BSA的Perm / Wash緩衝液稀釋1×在4°C下孵育30分鐘，將細胞以200× g離心 10分鐘。將細胞在150μl的1x Perm / Wash緩衝液中洗滌兩次，然後在4°C下用偶聯到Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，USA）的適當二抗染色30分鐘。將沉澱物在4°C下以800× g離心 5分鐘並用1x Perm / Wash緩衝液洗滌後，將其重懸於0.2 ml熒光激活細胞分選儀（FACS）緩衝液中，並通過流式細胞儀進行分析。
脾細胞的體外感染。爲了檢測SADS-CoV在小鼠脾臟細胞中的體外複製，從幼稚小鼠中提取脾細胞，接種在100-或35-mm皿中，並以MOI爲0.1感染SADS-CoV。在48 hpi時，收穫脾細胞並將其置於15 ml試管中，在4 × C下以200× g離心 10分鐘，然後如上所述通過流式細胞術進行分析。通過抗SADS-CoV-N抗體的免疫熒光檢測，檢測35毫米培養皿中感染的小鼠脾細胞，並在0、12、24、36、48和72 hpi收集感染上清液，用於一步定量RT- PCR分析。
用細胞標誌物染色對脾細胞進行FACS分析。將SADS-CoV感染的小鼠在3 dpi處以安樂死，並通過以下適當的抗體染色來製備脾細胞進行流式細胞術：抗SADS-CoV-AC，其後與Alexa Fluor 647（Thermo Fisher Scientific，USA）偶聯的二抗結合， B細胞用抗CD19-FITC（產品目錄號4318813; eBioscience），T細胞用抗CD4-PE（產品目錄號4329629; eBioscience），抗CD11 / c-PE-Cy7（產品目錄號561022; BD Bioscience） DC和巨噬細胞的抗F4 / 80-PE / Cy5（目錄號123111； Biolegend）。將染色的細胞重懸於0.2ml FACS緩衝液中，並通過流式細胞術分析。
S蛋白假型慢病毒的產生和轉導。如先前所述，產生了帶有各種CoV刺突蛋白的假病毒顆粒（38）。簡而言之，將編碼TGEV，SARS-CoV，MERS-CoV和小鼠肝炎病毒（MHV）S蛋白的每個質粒與pLenti-Luc-綠色熒光蛋白（GFP）和psPAX2質粒共轉染到293T細胞中（由朝暉提供）通過使用聚乙烯亞胺（PEI）以1：1：1的摩爾比加入中國醫學科學院北京協和醫科大學錢學強。在接下來的24小時內，用新鮮培養基餵養細胞，然後收集含有假病毒顆粒的上清液，並以800× g離心。 5分鐘以清除碎片。爲了量化S蛋白介導的假病毒顆粒的進入，將MDCK細胞以約25％至30％的融合度接種在24孔板中，並用pAPN-Flag，hDPP4-Flag，mCEACAM1a-Flag，hACE2-GFP進行轉染（由錢朝暉）（38），或使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）的對照主鏈載體。在轉染後24小時，用500μl1：1稀釋的相應假病毒顆粒接種過表達每種受體的MDCK細胞。在40 hpi，在室溫下用110μl具有等體積Steady-Glo（Promega，Madison，WI）的培養基裂解細胞。細胞裂解物還用於通過蛋白質印跡法確認每種受體的表達。使用Modulus II酶標儀（Turner Biosystems，Sunnyvale，CA）通過熒光素酶活性的定量監測轉導效率。另一方面，在轉染後24小時，將SADS-CoV（MOI，1）接種過表達每種受體的MDCK細胞。使用抗N pAb進行IFA以測試SADS-CoV敏感性。SADS-CoV在MDCK細胞中的複製能力由反向遺傳系統進一步確定。我們的實驗室最近描述了通過DNA發射的SADS-CoV（SeACoV）傳染性cDNA克隆（稱爲pSEA）的開發以及通過用pSEA轉染培養的細胞然後傳代Vero細胞來拯救SADS-CoV（24）。
倫理聲明。所有動物實驗均嚴格按照浙江大學實驗動物倫理委員會進行（批准文號：ZJU20170026）。