作者
Chaolin Huang*, Yeming Wang*, Xingwang Li*, Lili Ren*, Jianping Zhao*, Yi Hu*, Li Zhang, Guohui Fan, Jiuyang Xu, Xiaoying Gu, Zhenshun Cheng, Ting Yu, Jiaan Xia, Yuan Wei, Wenjuan Wu, Xuelei Xie, Wen Yin, Hui Li, Min Liu, Yan Xiao, Hong Gao, Li Guo, Jungang Xie, Guangfa Wang, Rongmeng Jiang, Zhancheng Gao, Qi Jin, Jianwei Wang, Bin Cao
概述
背景 中國武漢市最近發生的一系列肺炎病例是由新型β冠狀病毒（2019-nCoV）引起的。 本文報告了這些患者的流行病學分析、臨牀分析、實驗室分析、放射學特徵以及治療方案和臨牀反應。
調查方案 所有疑似2019-nCoV的患者均被送往武漢的一家指定醫院（金銀潭醫院）。 我們通過實時逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和下一代測序前瞻性收集和分析了實驗室確診的2019-nCoV感染患者的數據。 數據格式按由世界衛生組織和國際嚴重急性呼吸及新興感染聯合會設定的標準化數據收集表編寫，從患者電子病歷中獲取的。 研究人員還直接與患者或其家人溝通以確定流行病學和臨牀症狀的數據。 文中對比分析入住重症監護病房（ICU）和未入住重症監護病房的患者的臨牀反應。
調查結果
- 截至2020年1月2日，已確認有41名入院患者被實驗室確診感染2019-nCoV病毒。
- 大多數被感染者是男性（41名患者中的30名[73％]）；
- 患者中不到一半的人患有基礎疾病（13 [32％]），包括糖尿病（8 [20％]）、高血壓（6 [15％]）和心血管疾病（6 [15％]）。
- 患者年齡中位數爲49歲（IQR 41·0–58·0）。
- 41例患者中有27例（66％）曾接觸過華南海鮮市場。
- 發現一個家庭集羣案例。
- 發病時的常見症狀爲發燒（41例患者中的40例[98％]），咳嗽（31例[76％]）和肌痛或疲勞（18例[44％]）；
- 較不常見的症狀是痰液產生（佔39的11 [28％]），頭痛（佔38的3 [8％]），咯血（佔39的2 [5％]）和腹瀉（佔38的1 [3％]）。
- 40名患者中有22名（55％）出現了呼吸困難（從發病到呼吸困難的時間中位數爲8天[IQR 5·0-13-1·0]）。
- 41名患者中有26名（63％）患有淋巴細胞減少症。
- 全部41例患者均患有肺炎，胸部CT檢查發現異常。
- 併發症包括急性呼吸窘迫綜合徵（12 [29％]），RNA血癥（6 [15％]），急性心臟損傷（5 [12％]）和二次感染（4 [10％]）。
- 13例（32％）患者被送入ICU，六例（15％）死亡。
- 與非ICU患者相比，ICU患者的血漿IL2，IL7，IL10，GSCF，IP10，MCP1，MIP1A和TNFα更高。
註釋 2019-nCoV病毒感染會導致羣體性嚴重呼吸系統疾病（該現象與SARS類似）並伴有大量危重病例和高致死率。我們對該病毒的病毒來源，傳播途徑，持續在人體傳播時間和疾病臨牀表現極度缺乏認識，這需要通過未來的研究來彌補。
贊助 科技部，中國醫學科學院，國家自然科學基金委員會和北京市科學技術委員會。
介紹
冠狀病毒是屬於冠狀病毒科和Nidovirales的有包膜的非節段的陽性RNA病毒，廣泛分佈於人和其他哺乳動物中。 儘管大多數人類冠狀病毒感染都是輕度感染，但在過去的二十年中，兩種β冠狀病毒（嚴重的急性呼吸系統綜合症冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸系統綜合症冠狀病毒（MERS-CoV））的流行已導致超過10,000例病例 ，SARS-CoV的死亡率爲10％，MERS-CoV的死亡率爲37％。 已經鑑定出的冠狀病毒可能只是冰山一角，可能還會發現更多新穎和嚴重的人畜共患病事件。
2019年12月，中國湖北武漢市出現了一系列原因不明的肺炎病例，臨牀表現與病毒性肺炎非常相似。對下呼吸道樣品的深度測序分析顯示出一種新型冠狀病毒，被命名爲2019年新型冠狀病毒（2019年 -nCoV）。 迄今爲止，在武漢已經確認了800例確診病例，包括醫護人員，在中國其他省份以及泰國，日本，韓國和美國也確診了一些跨境病例。
我們旨在描述證實患有2019-nCoV感染的患者的流行病學，臨牀，實驗室和放射學特徵，治療和結局，並比較重症監護病房（ICU）和非ICU患者的臨牀特徵。 我們希望我們的研究結果將使這種新型冠狀病毒的出現及其臨牀特徵告知全球社區。
方法
患者
武漢市報告了原因不明的肺炎病例，並考慮到患者之間共同接觸華南海鮮市場的歷史，地方衛生部門於2019年12月31日發出了流行病學預警，並於2020年1月1日關閉市場。與此同時，從2019年12月31日起，將59例發燒和乾咳的疑似病例轉移到指定的醫院。預警發出後不久，一個由醫生、流行病學家、病毒學家和政府官員組成的專家團隊成立。
由於這些新發感染的發病原因未知，因此武漢市不明原因的肺炎的診斷基於臨牀特徵，胸部影像學和排除引起肺炎的常見細菌和病毒病原體。疑似患者被隔離在用戶預防空氣傳播傳染病的定點醫院——武漢金銀潭醫院，同時對這批患者進行了N95口罩的適合性測試並採取了預防空氣傳播的氣霧生成預防措施。本研究得到中國國家衛生委員會和倫理委員會金銀灘醫院的批准（KY-2020-01.01）。指定醫院新發傳染病的道德委員會放棄了書面知情同意書。
步驟
當地疾病預防控制中心收集了呼吸，血液和糞便標本，然後將它們運送到指定的權威實驗室以檢測病原體（NHC病原體系統生物學重點實驗室和Christophe Me’rieux實驗室，中國北京）。然後從下呼吸道標本中分離出一種新的冠狀病毒，命名爲2019-nCoV，此後不久就對該病毒進行了診斷測試。在59例疑似病例中，證實有41例患者被2019-nCoV感染。通過下一代測序或實時RT-PCR方法檢測到呼吸道標本中存在2019-nCoV。使用了CoV的包膜基因的引物和探針靶，其序列如下：正向引物****、反向引物****、探針****。實驗繁殖的條件爲50°C 15分鐘，95°C 3分鐘，然後是45個循環，分別是95°C 15 s和60°C 30 s。
初步調查包括全血細胞計數，凝血特性和血清生化測試（包括腎和肝功能，肌酸激酶，乳酸脫氫酶和電解質）。使用經中國食品藥品監督管理局批准的實時RT-PCR檢測方法，對呼吸道標本（包括鼻和咽拭子，支氣管肺泡灌洗液，痰或支氣管吸出液）進行了常見病毒的測試（包括流感、禽流感、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、SARS-CoV和MERS-CoV）。 還進行了常規細菌和真菌檢查。
鑑於在流感季節期間出現了2019-nCoV肺炎病例，經驗性地使用了抗生素（口服和靜脈內）和奧司他韋（口服75 mg，每天兩次）。 如果指定醫院的醫生診斷出嚴重的社區獲得性肺炎則聯合使用皮質類固醇療法（每天使用甲潑尼龍40-120 mg）作爲聯合治療方案。 根據低氧血癥的嚴重程度向患者給予氧氣支持（例如鼻插管和有創機械通氣）。 對確診爲2019-nCoV感染的患者進行重複的2019-nCoV檢測，以顯示出院或中斷隔離之前的病毒清除率。
數據收集
我們審查了當地衛生局報告的所有實驗室確診爲2019-nCoV感染的患者的臨牀圖表，護理記錄，實驗室檢查結果和胸部X光片。 這些患者的入院數據爲2019年12月16日至2020年1月2日。根據流行病學、臨牀、實驗室和放射學特徵以及治療和結局數據通過標準化數據收集表（特徵病例記錄表由世衛組織和國際嚴重急性呼吸與新興感染聯合會承認適用於SARS臨牀)。 兩名研究人員還獨立審查了數據收集表以仔細檢查收集的數據。 爲了確定流行病學和症狀數據（這些數據無法從電子病歷中獲得）研究人員還直接與患者或其家屬進行交流。
細胞因子和趨化因子的測量
爲了表徵冠狀病毒對疾病急性期細胞因子或趨化因子產生的影響，根據製造商的說明，爲所有患者提供血漿細胞因子和趨化因子檢測。來自四個健康成年人的血漿樣品用作交叉比較的對照。患者從轉移到指定醫院到採集血液樣本的時間間隔中位數爲4天（IQR 2-5）。
血漿中冠狀病毒的檢測
將來自患者和接觸者的每份80 µL血漿樣品添加到生物安全等級3實驗室的240 µL Trizol LS中。按照製造商的說明，使用Direct-zol RNA Miniprep試劑盒提取總RNA，每個樣品獲得50 µL洗脫液。 5 µL RNA用於實時RT-PCR，使用AgPath-ID一步式RT-PCR試劑靶向NP基因。引物的最終反應混合物濃度爲500 nM，探針爲200 nM。使用以下條件進行實時RT-PCR：50°C持續15分鐘，95°C持續3分鐘，在95°C進行10 s擴增，並在60°C進行45 s擴增。由於我們沒有進行檢測血液中傳染性病毒的測試，因此我們避免使用病毒血症一詞，而改爲使用RNA血癥。 RNA血癥被定義爲血漿樣品中實時RT-PCR的陽性結果。
定義
急性呼吸窘迫綜合徵（ARDS）和休克是根據WHO對新型冠狀病毒的臨時指導定義的。低氧血癥的定義是動脈血氧分壓（PaO 2）超過吸氧分數（FIO 2）小於300 mm Hg。根據改善整體結局分類的腎臟疾病，根據最高的血清肌酐水平或尿量輸出標準對急性腎臟損傷進行了識別和分類。如果患者具有臨牀症狀或醫院內肺炎或菌血症跡象，並與來自下呼吸道標本（包括痰液，氣管吸出物或支氣管肺泡灌洗液，或來自入院後48小時內採集的血液樣本）。心臟損傷遵循了我們先前對H7N9患者進行的研究中的定義。簡而言之，如果心臟生物標誌物（例如肌鈣蛋白I）的血清水平高於參考值的99％，或者心電圖和超聲心動圖顯示新異常，則可診斷爲心臟損傷。
數據分析
連續變量表示爲中位數（IQR），並與Mann-Whitney U檢驗進行比較； 分類變量以數字（％）表示，並通過χ²檢驗或Fisher精確檢驗在ICU護理和無ICU護理組之間進行比較。 繪製箱形圖以描述血漿細胞因子和趨化因子濃度。 小於0·05的雙向α被認爲具有統計學意義。 除非另有說明，否則使用SAS軟件9.4版進行統計分析。
結果
截至2020年1月2日，武漢市共有41名入院患者被確定爲實驗室確診的2019-nCoV病毒感染。在2019-nCoV病毒感染的患者中，有20名[49％]年齡在25-49歲之間，有14名（34％）在50-64歲之間（圖1A）。患者的中位年齡爲49·0歲。截至1月2日，在我們的前41名患者中，沒有兒童或青少年受到感染。在41例患者中，有13例（32％）因需要高流量鼻導管或更高水平的氧氣支持措施來糾正低氧血癥而被送入ICU。大多數感染的患者是男性（30 [73％]）；不到一半的人患有基礎疾病（13 [32％]），包括糖尿病（8 [20％]），高血壓（6 [15％]）和心血管疾病（6 [15％]）。
27名（66％）患者直接接觸了華南海鮮市場（圖1B）。接觸海鮮市場在ICU患者（9 [69％]）和非ICU患者（18 [64％]）中比例相似。首例確診患者的症狀發作日期爲2019年12月1日，其家人未出現發燒或呼吸道症狀。首例患者和之後的病人間未發現任何流行病學聯繫。首例致死病例在海鮮市場工作，經過了持續7天的發燒、咳嗽和呼吸困難症狀後入院治療。 該病例發病5天后，他的妻子（一位53歲的女性）已知沒有接觸海鮮市場的經歷也被感染肺炎送往隔離病房住院。
發病時最常見的症狀是發燒（41名患者中的40名[98％]），咳嗽（31名[76％]）和肌痛或疲勞（18名[44％]）。 較少見的症狀是痰液產生（39的11 [28％]），頭痛（38的3 [8％]），咯血（39的2 [5％]）和腹瀉（38的1 [3％]）；表 1）。 一半以上的患者（40名中的22名[55％]）發展爲呼吸困難。 從發病到呼吸困難的中位持續時間爲8·0天（IQR 5·0-13-1·0）。 從症狀發作到第一次入院的中位時間爲7·0天（4·0–8·0），到呼吸短促爲8·0天（5·0-13·0），到ARDS的中位時間爲9· 0天（8·0-14·0），機械通氣爲10·5天（7·0-14·0），入ICU的時間爲10·5天（8·0-17·0；圖2 ）。
入院患者的血細胞計數顯示白細胞減少症（白細胞計數低於4×10⁹/ L； 40例患者中的10個[25％]）和淋巴細胞減少症（淋巴細胞計數<1·0×10⁹/ L； 26 [63％]） 患者；表2）。 ICU患者入院時凝血酶原時間和D-二聚體水平較高（凝血酶原中位時間爲12·2 s [IQR 11·2-13·4]；中位D-二聚體水平爲2·4 mg / L [0·6-14] ·[4]）比非ICU患者（凝血酶原中位時間10·7 s [9·8-12·1]，p = 0·012；中位D-二聚體水平0·5 mg / L [0·3-0] ·8]，p = 0·0042）。 41名患者中有15名（37％）的天冬氨酸轉氨酶水平升高，包括13名ICU患者中的8名（62％）和28名非ICU患者中的7名（25％）。 過敏性肌鈣蛋白I（hs-cTnI）大大增加了五名患者，其中病毒相關的心臟損傷的診斷。
多數患者入院時血清降鈣素水平正常（降鈣素<0·1 ng / mL； 27名[69％]患者；表2）。 四名ICU患者發生繼發感染。 四名繼發感染患者中的三名降鈣素原大於0·5 ng / mL（0·69 ng / mL，1·46 ng / mL和6·48 ng / mL）。
入院時，在所有患者中均檢測到胸部CT圖像異常。 在41例患者中，有40例（98％）有雙側受累（表2）。 ICU患者入院時胸部CT圖像的典型發現是雙側多發性小葉和段下鞏固區（圖3A）。 非ICU患者的代表性胸部CT表現顯示雙側玻璃管混濁和下段鞏固區域（圖3B）。 後來的胸部CT圖像顯示雙側毛玻璃樣混濁，而固結已解決（圖3C）。
ICU患者和非ICU患者的初始血漿IL1B，IL1RA，IL7，IL8，IL9，IL10，鹼性FGF，GCSF，GMCSF，IFNγ，IP10，MCP1，MIP1A，MIP1B，PDGF，TNFα和VEGF濃度均高於 在健康的成年人中（附錄第6-7頁）。 健康成年人和感染2019-nCoV的患者的血漿IL5，IL12p70，IL15，嗜酸性粒細胞趨化因子和RANTES水平相似。 ICU患者與非ICU患者之間的進一步比較表明，ICU患者的IL2，IL7，IL10，GCSF，IP10，MCP1，MIP1A和TNFα的血漿濃度高於非ICU患者。
所有患者均患有肺炎。 常見併發症包括ARDS（41例患者中的12例[29％]），其次是RNA血癥（6例[15％]例），急性心臟損傷（5例[12％]例）和二次感染（4例[10％]例）； 表3）。 四名（10％）患者需要有創機械通氣，其中兩人（5％）患有難治性低氧血癥並接受體外膜氧合作爲挽救療法。 所有患者均接受了經驗性抗生素治療，其中38例（93％）患者接受了抗病毒治療（奧司他韋）。 此外，有9名（22％）患者接受了系統性皮質激素治療。 附錄（第1-5頁）比較了接受和不接受系統性皮質類固醇的患者之間的臨牀特徵。
截至2020年1月22日，41名患者中的28名（68％）已出院，六名（15％）患者已死亡。 出院適應性的基礎是至少消退10天的發燒，並改善胸部放射學證據和上呼吸道呼吸道樣本的病毒清除率。
討論
我們在這裏報告了41名實驗室確診爲2019-nCoV感染的患者。這批患者均是重症患者部分爲危重症患者於2020年1月2日被送往武漢指定醫院。臨牀表現與SARS-CoV非常相似。重症患者發展爲呼吸衰竭(ARDS)需送入ICU病房並呼氧治療。患者從入院治療到出現呼吸衰竭症狀的時間間隔短至2天。根據當前情況判斷2019-nCov病毒致死率很高，這批41人的患者中已有6人(15%)死亡。
中國國內死亡人數在迅速攀升。截至2020年1月24日，中國報告了835例實驗室確診的2019-nCoV病毒感染者，其中已有25例死亡。在中國其餘省份及其他國家已報道出現跨境病例；武漢也有一些醫護人員被感染。迄今爲止的證據表明，2019-nCoV具備人傳人的能力。我們擔心2019-nCoV病毒可能具備快速人傳人能力，因此強烈建議相關機構採用預防空氣傳播的防疫措施（例如使用經安全檢測的N95口罩和其他個人護理裝備）。爲防止該疾病在收治病毒感染者的醫療機構中進一步傳播，應對醫療人員採取嚴密的發燒及呼吸道症狀監測。一旦出現疑似症狀應立即進行呼吸道採樣測試。在醫護人員接觸患者前後時段都應進行血清抗體測試，以預防無症狀感染的出現。
我們已經注意到2019-nCoV病毒感染者和之前的β型冠狀病毒感染者具有相似臨牀反應。這批患者中大多數表現出發燒、乾咳、呼吸困難等症狀，且胸部CT掃描顯示肺部雙側呈毛玻璃狀混濁。2019-nCoV病毒感染者的這些特徵與SARS和MERS感染者有些相似。但很少有2019-nCoV感染者出現明顯的上呼吸道症狀（例如，鼻涕、打噴嚏或喉嚨痛）表明該病毒的靶向細胞可能位於下呼吸道。此外2019-nCoV感染者很少出現腸道症狀（例如腹瀉），而約20–25％的MERS或SARS感染者有腹瀉症狀。後續我們將對患者的糞便和尿液樣本進行測試以排除現階段未知的可能傳播途徑。
尚未完全瞭解SARS或MERS病毒異常高致病率的病理原因。早期研究表明，SARS患者血清中促炎性細胞因子(IL1B, IL6, IL12, IFNγ, IP10, and MCP1)數量的增加與肺部炎症和進一步的肺部損傷相關。據報道感染MERS會導致患者體內促炎性細胞因子(IFNγ, TNFα, IL15, and IL17)的濃度增加。我們注意到被2019-nCoV感染的患者也具有大量的促炎性細胞因子( IL1B, IFNγ, IP10, and MCP1)，可能會導致活化的T-helper-1（Th1）細胞反應。此外入住ICU的危重患者比不需要入住ICU的患者具有更高的GCSF、IP10、MCP1、MIP1A和TNFα因子濃度，這表明細胞因子風暴與疾病嚴重程度有關。然而與感染SARS不同，感染2019-nCoV病毒還引發抑制炎症的T-helper-2（Th2）細胞因子（例如IL4和IL10）分泌增加。有必要進一步地研究以鑑定2019-nCoV感染者中的Th1和Th2細胞反應以闡明發病機理。屍檢或活體病毒檢測將是瞭解該疾病的關鍵。
由於感染SARS、MERS和2019-nCoV病毒會導致患者體內產生大量細胞因子，皮質類固醇激素常用於治療重症患者以減輕炎症性肺損傷。 但最新證據表明SARS和MERS患者接受皮質類固醇激素後對其死亡率沒有影響，但會延遲患者體內病毒清除。根據世界衛生組織的臨時指導意見，治療時不應常態化對患者注射皮質類固醇激素。在我們的41名經實驗室確診的2019-nCoV感染者中，非ICU病例很少接受皮質類固醇治療，而重症呼吸衰竭患者中有不到一半給予中低劑量的皮質類固醇治療。迫切需要進一步的證據來系統性評估皮質類固醇激素對2019-nCoV感染者的治療是否有益。
目前爲止沒有任何反病毒治療方案被醫學證明是行之有效的。歷史對照實驗研究顯示，對SARS患者綜合使用洛匹那韋/利托那韋獲得不錯的臨牀表現（較少不良臨牀反應）。在沙特阿拉伯，Arabi及其同事對MERS患者進行了干擾素β-1b、洛匹那韋/利托那韋的安慰劑對照試驗。 非臨牀證據顯示瑞德西韋(Remdesivir，廣譜抗病毒核苷酸前藥)對治療MERS和SARS是有效的。由於2019-nCoV是一種新興病毒，對該病毒引發疾病尚未開發出有效治療方案。金銀潭醫院備有洛匹那韋/利托那韋藥物現已快速啓動了一項隨機對照實驗，以評估洛匹那韋/利托那韋藥物對2019-nCov患者的療效和安全性。
我們的研究也存在一些侷限性。首先這批41例患者中的大多數人通過採集其下呼吸道樣本已確診感染，由於沒有獲得對應的鼻咽拭紙難以分析病毒RNA檢測率在患者上下呼吸道樣本間的差異。因爲未做血清檢測我們無法得知18名未檢測到病毒RNA的患者體內是否存在2019-nCov抗體升高的現象。其次受限於病例數量，研究人員難以通過多變量調整方法評估病毒宿主危險因子（包括疾病嚴重程度和死亡率）。這是一批中等規模的入院患者病理，進一步收集更大規模患者的標準化數據將有助於確定疾病的臨牀表現、自然病史和危險因子。需要對門診、初級保健和社區醫院進行進一步調查才能瞭解病情臨牀嚴重程度的全貌。同時對統計數據和p值的醫學闡述持謹慎態度，較低的p值並不一定能消除ICU與非ICU患者間的差異。第三，由於剛剛確定病毒的病原體，尚無病毒滴定濃度和抗體滴定濃度的動力學數據。最後我們研究中潛在的暴露偏差是導致患者羣體中沒有兒童或青少年病例的可能原因。在以後的研究中，將付出更多的努力來回答這些問題。
當前研究認爲，SARS和MERS病毒均源自蝙蝠並分別通過市場上的麝貓和單峯駱駝直接傳播給人類。對SARS和MERS病毒的持續研究推動研究人員從蝙蝠中體內多種類SARS和類MERS冠狀病毒的發現。2013年，Ge及其同事通報了蝙蝠體內類SARS冠狀病毒的完整基因組序列，該病毒具有使用人體ACE2作爲受體的能力因此具有在人體細胞中繁殖的潛力。鑑於2019-nCoV病毒成爲全球健康威脅仍需對其進行深入研究。在與疑似患者的首次接觸中，快速病原體檢測和基於臨牀描述的可行診斷對臨牀醫生至關重要。由於2019-nCoV病毒具有大範圍傳播的潛力，必須仔細監測其未來的宿主適應性、病毒進化、傳染性、傳播性和致病性等特徵。